原核系统，蛋白表达纯化实验。

原核蛋白表达纯化

Day-01 表达菌株制备

1. 配置并灭菌大瓶的培养基（根据需要选择是否同时灭小摇用的锥形瓶和多配1L LB备用）。
2. 配置蛋白胶4-6块备用。
3. 检查100mg/ml Amp母液、50mg/ml Kana母液、1M IPTG母液余量，不够则提前配。
4. 检查1M tris-Hcl母液（pH7.0, 或pH8.0）、0.5M MES 母液、5M氯化钠母液、5M咪唑母液剩余量，不够则提前配。
5. 质粒转化，涂板生长过夜。

Day-02 蛋白表达

1. 早上8点挑菌小摇。
2. 6-8小时后，检查小摇菌液浑浊情况；浑浊菌液1：100体积比接种大摇。
3. 大摇2小时后即观察菌液培养情况，检测OD600nm吸收值。在OD0.6-1.0期间，将摇床和菌液降至目的蛋白诱导温度之后，在超净台中加IPTG诱导。诱导表达可以调低转速（180 rpm或150 rpm）。
4. 诱导表达温度，与诱导表达时长，因目的蛋白而异，根据提前做的小量表达测试预实验决定。

Day-03 蛋白纯化

1. 观察摇菌浑浊情况：4号大摇床，共有4瓶1L 细菌。拉出摇床的底板，然后取出摇瓶。观察每瓶菌液摇菌的情况，是否是显著浑浊的状态，理论上应该和昨天加IPTG时的菌体浑浊程度相当。如果菌液很澄清，则出现了噬菌体污染，摇菌失败。
2. 离心收菌：首先打开大离心机，设置好温度4度，转速3800转，时间20分钟，盖上盖则离心机自动开始预冷。然后用水清洗4个离心筒，之后将每个摇瓶的菌液倒入离心筒中，注意在离心筒上做好样品标记。接着使用天平和洗瓶里的水进行配平，放入离心机中开始离心。最后，收完菌的大摇瓶先放水池。最后准备好重悬buffer (50mM Tris-HCl缓冲液，200mM NaCl，20mM IMD即咪唑)，放冰上预冷。此时，打开高压破碎仪，使其开始4度预冷。打开高速离心机，使其开始4度预冷。
3. 重悬菌体沉淀：离心结束后，首先将上清（即不含细菌的LB）倒在上一步用过的摇瓶中，然后每1L废液LB中加一片84消毒片，或者84消毒液10ml，灭菌20分钟。将菌体加入重悬buffer，使用vortex进行充分重悬（以没有菌体沉淀块为准），每升菌液对应的菌体约加入50ml 重悬buffer。重悬之后的菌液，根据体积大小转移入50ml离心管中，或者洗净的烧杯中（洗烧杯先用水清洗，再加超纯水刷洗）。