Western-blotting-实验步骤自整理。

跑胶

1. 与考染跑胶步骤相同。

转膜

以下为湿转的实验步骤。注意，湿转过程要保持低温。

1. 事先预冷转膜液；
2. 脸盘打冰，冰水混合物，水液面高度5cm；
3. 转膜槽，放入冰水混合物中，倒入预冷的转膜液。
4. 取瓷盘：倒入转膜液，润湿转膜海绵、两份三层转膜滤纸。
5. 取装膜的盒子：倒入甲醇，润湿PVDF膜一分钟；之后PVDF膜放在转膜液中。
6. 在瓷盘中，转膜夹板平放，黑色夹板在下，依次放上一层海绵、润湿的三层转膜滤纸、跑好的切除了浓缩胶的蛋白胶、润湿的PVDF膜、润湿的三层转膜滤纸、一层海绵（避免放这几层的过程中产生气泡，有气泡则用玻璃棒赶走）。之后平稳地夹好白色转膜夹板（此时就是“三明治”转膜夹板，检查确认黑色夹板靠近胶，白色夹板靠近膜，即“黑胶白膜”）。
7. 将“三明治”转膜夹板，按照正负极对应关系放入转膜槽中。黑色与负极连接，白色与正极连接。
8. 设置恒流200mA,转膜2h。 如果转膜仪没有定时停止功能，则自行记录转膜时间。

封闭

根据要检测的目的蛋白性质，选择使用脱脂牛奶或者BSA进行封闭。

质量浓度5%的脱脂牛奶或5%的BSA，溶于1乘TBST溶液中（置于旋转混合仪上溶解，大概10分钟左右完全溶解）。

封闭步骤一般是，室温封闭一小时。

孵育抗体

分为孵育一抗，和二抗。

化学发光检测

俗称，曝光。

1：1体积比配置ECL化学发光液。

Chemidoc 仪器，

新建protocol - blots - Chemi Hi Sensitivity - 设置信号曝光时间

参考